4.3用于阿爾茨海默病生物標(biāo)志物檢測

阿爾茨海默病的神經(jīng)紊亂是進(jìn)行性且不可逆的，會導(dǎo)致患者記憶喪失，且患者后期一般生活無法自理。β-淀粉樣蛋白是臨床早期診斷阿爾茨海默病的生物標(biāo)志物。目前，已經(jīng)有適配體生物傳感器用于Aβ蛋白檢測，基于這種電化學(xué)生物傳感器開發(fā)的檢測設(shè)備，具有靈敏度高、操作簡單、性能穩(wěn)定、成本低、可小型化的優(yōu)點，有較好的臨床應(yīng)用前景。

ZHANG等發(fā)現(xiàn)，具有電活性的莖環(huán)適配體被固定在金電極上后，適配體上修飾的電活性物質(zhì)二茂鐵（Fc）可通過識別淀粉樣蛋白寡聚體前后的構(gòu)象變化導(dǎo)致的電荷轉(zhuǎn)移量的變化來檢測淀粉樣蛋白寡聚體，莖環(huán)（B-3'Fc）適配體與淀粉樣蛋白寡聚體結(jié)合后，F(xiàn)c峰電流會降低；此外，通過優(yōu)化交流伏安法的檢測頻率，可以進(jìn)一步降低傳感器的檢測限，但同時會使檢測范圍變窄；基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了一種基于莖環(huán)的電化學(xué)適配體傳感器，可高選擇性和高靈敏度地定量亞皮摩爾濃度的淀粉樣蛋白寡聚體，可能有利于阿爾茨海默病的診斷。

4.4病原微生物標(biāo)志物檢測

微生物中的致病菌可以導(dǎo)致人類疾病，給人類健康和公共衛(wèi)生帶來諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的微生物檢測方法需要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)病原菌，然后進(jìn)行鑒定。用這種方法得到的結(jié)果雖然準(zhǔn)確，但是至少需要4～7 d才能得到結(jié)果。其他方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗，依賴于抗原-抗體反應(yīng)，易受pH值和溫度等環(huán)境因素的影響。電化學(xué)適配體生物傳感器病原體檢測技術(shù)具有操作簡單、成本低、靈敏度高、信號穩(wěn)定、可小型化等諸多優(yōu)勢，且可與微制造工藝兼容，并進(jìn)行真實樣品檢測。

DAI等發(fā)現(xiàn)，具有反式切割活性的Cas12a核酸內(nèi)切酶可對單鏈DNA啟動反式切割，將標(biāo)記有亞甲基藍(lán)的單鏈DNA固定在金電極電化學(xué)傳感器，在待測物存在的條件下，Cas12acrRNA可啟動對非特異性單鏈DNA的反式切割，使亞甲藍(lán)的電流降低；基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了一種基于CRISPR Cas12a（cpf1）的電化學(xué)生物傳感器——E-CRISPR，為了證明其系統(tǒng)通用性，他們將開發(fā)的E-CRIPSR首次應(yīng)用于人乳頭瘤病毒和細(xì)小病毒B1916核酸檢測，結(jié)果顯示，由于優(yōu)化了Cas12a體外反式切割的化學(xué)環(huán)境，無需任何酶促進(jìn)擴增，E-CRISPR達(dá)到了皮摩爾水平的檢測限；他們進(jìn)一步設(shè)計了基于E-CRISPR級聯(lián)的蛋白質(zhì)靶點，用于檢測臨床樣本中的轉(zhuǎn)化生長因子-β1蛋白。相信在電化學(xué)和CRISPR的結(jié)合下，E-CRISPR可以成為便攜、精準(zhǔn)和低成本的即時診斷系統(tǒng)的強大推動力。E-CRISPR的檢測原理見圖3。

圖3 E-CRISPR的檢測原理

5總結(jié)和展望

適配體傳感器在生物標(biāo)志物的定量和定性檢測上有很多的應(yīng)用。寡核苷酸適配體被認(rèn)為是可識別生物標(biāo)志物的智能分子。但是，盡管適配體已經(jīng)被用于多種傳感平臺，仍有很多需要解決的問題和挑戰(zhàn)。

（1）大規(guī)模生產(chǎn)DNA/RNA適配體成本較高，且由于酶的存在，許多適配體在人血液中會被快速降解。有研究發(fā)現(xiàn)，添加具有生物相容性的官能團(tuán)可提高其耐酶性；開發(fā)異種核酸作為有效和通用的適配體，在適配體的實際應(yīng)用中也有較好的前景。

（2）靈敏度需要進(jìn)一步提高。將適配體與量子點、金屬納米粒子等納米材料結(jié)合，采用DNA納米機器和滾動圓放大、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)，可以提高適配體傳感器的靈敏度。ZHANG等提出了一種組裝方法——Bindinginduced DNA，可以檢測復(fù)雜樣本中低濃度的目標(biāo)分子，這種檢測方法可以應(yīng)用于脂類、核酸、低聚糖、病毒和病原體等多種生物分子的檢測。另外，信號放大也是在極低濃度被測物條件下提高檢測靈敏度的有效策略。

（3）適配體臨床檢測應(yīng)用受限。雖然目前關(guān)于適配體傳感器的研究較多，但因信噪比較低、細(xì)胞基質(zhì)和體液可能會掩蔽適配體、多通道檢測困難等不足，使適配體傳感器的臨床應(yīng)用受到很大限制。傳感器的設(shè)計方面，可以將多個適配體固定在檢測平臺上，以同時檢測多種疾病標(biāo)志物；另外，以納米技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測平臺，有望實現(xiàn)高選擇性、高特異性、低成本、高效、快速、多通道檢測的目標(biāo)。相信隨著研究的不斷深入，適配體傳感器會廣泛應(yīng)用于臨床檢測。