細(xì)胞內(nèi)pH水平對(duì)于維持細(xì)胞的正常運(yùn)行以及生理系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用。細(xì)胞內(nèi)酶的活性，信號(hào)的傳導(dǎo)，離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡以及系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)平衡等都與pH緊密相關(guān)。pH的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器功能出現(xiàn)障礙，例如溶酶體的pH值一般維持在4.5～6.5的酸性環(huán)境中，pH異常會(huì)影響大分子的代謝和細(xì)胞正?；顒?dòng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常凋亡，甚至?xí)?dǎo)致痛風(fēng)、阿爾茲海默癥、癌癥等多種疾病。由于pH對(duì)所有生命體而言都至關(guān)重要，因此精確監(jiān)測(cè)pH的變化至關(guān)重要。目前，已開(kāi)發(fā)出多種技術(shù)手段用于測(cè)定pH值，例如微電極、核磁共振、吸收光譜等方法。其中，熒光光譜法由于靈敏度高、信噪比高、響應(yīng)速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)生物傳感領(lǐng)域。然而，大多數(shù)pH熒光探針都是基于有機(jī)小分子熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成的，存在光穩(wěn)定性差、生物相容性差、毒性高、制備過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其在生物體系中的廣泛應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)用于監(jiān)測(cè)生理環(huán)境中pH變化的新型熒光探針對(duì)于研究受pH影響的相關(guān)的疾病具有重要意義。

碳基納米材料由于具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和低毒性等突出的優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。碳點(diǎn)（CDs）作為一種新興的具有熒光特性的碳基納米材料，在2004年被Walter A.Scrivens等在碳納米管電泳實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)。2006年Sun Ya-Ping課題組將其定義為“碳點(diǎn)”并建議鈍化表面以?xún)?yōu)化其性能。由于CDs優(yōu)良的熒光特性、易于功能化、制備原料來(lái)源廣泛、制備方法多樣等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在生物、化學(xué)、材料等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，CDs通常具有較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性，作為熒光探針在檢測(cè)生理環(huán)境中的小分子應(yīng)用中具有良好的發(fā)展?jié)摿ΑＦ渲?，最為突出的是用于pH熒光探針。通過(guò)pH變化導(dǎo)致碳點(diǎn)表面結(jié)構(gòu)或電子分布的改變，從而引起熒光信號(hào)改變的機(jī)理，可以設(shè)計(jì)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞環(huán)境不同區(qū)域的pH變化過(guò)程。然而，若未經(jīng)修飾或鈍化等步驟的CDs仍然存在量子產(chǎn)率較低、表面功能基團(tuán)較少等問(wèn)題，從而限制其在pH傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。為了拓寬其應(yīng)用范圍，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)CDs表面進(jìn)行功能化修飾和化學(xué)摻雜是改善其缺點(diǎn)的兩個(gè)非常有效的途徑。功能化修飾一般要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的合成和純化步驟，所得的產(chǎn)率較低并會(huì)影響CDs的固有性質(zhì)，這大大限制了其在分析傳感中的應(yīng)用。化學(xué)摻雜（金屬元素?fù)诫s和非金屬元素?fù)诫s）則由于制備過(guò)程簡(jiǎn)便和高效的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，其中摻雜金屬元素可以有效地改善CDs的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或電子分布，從而影響其物理或化學(xué)性質(zhì)。不同金屬離子的摻雜會(huì)對(duì)CDs的熒光量子產(chǎn)率（QYs）造成不同程度的影響，這可能源于摻雜的金屬離子改變了CDs的幾何結(jié)構(gòu)或電子結(jié)構(gòu)。因此，制備新型金屬摻雜碳點(diǎn)，探索其作為熒光探針在不同pH范圍內(nèi)的響應(yīng)情況，對(duì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域pH的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)相關(guān)疾病的影響非常重要。

本文以鄰苯二胺和血紅素為前驅(qū)體通過(guò)一步水熱法制備了表面多種官能團(tuán)的鐵摻雜黃色熒光碳點(diǎn)（Fe-CDs），通過(guò)多種分析表征證明Fe-CDs具有良好的水溶性和穩(wěn)定的光學(xué)性能。由于其表面豐富的氨基、羧基等官能團(tuán)及鐵元素的摻雜，F(xiàn)e-CDs可以作為熒光探針用于酸性環(huán)境下的pH檢測(cè)。同時(shí)Fe-CDs具有較低的細(xì)胞毒性，易于被細(xì)胞攝取，可通過(guò)熒光成像手段監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH的水平變化，并且在研究因pH波動(dòng)而影響的生理變化中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

主要試劑：鄰苯二胺，血紅素購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich試劑有限公司。所有實(shí)驗(yàn)用藥品均為分析純，且使用時(shí)未經(jīng)附加處理。實(shí)驗(yàn)用水為由美國(guó)Milli-Q超純水儀制得的超純水。

主要儀器：JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社JEOL）；Cary670型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；U-2910型紫外可見(jiàn)吸收光譜儀（HITACHI LTD）；F-4500型熒光/磷光分光光度計(jì)（HITACHI LTD）；Zetasizer Nano ZS90型粒度電位儀（Malven）；AXIS ULTRA DLD型X-射線(xiàn)光電子能譜儀（日本Kratos公司）；FV1000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

圖1 Fe-CDs的合成路徑及應(yīng)用示意圖

1.2 Fe-CDs的制備方法

分別稱(chēng)取0.01 g血紅素和0.1 g鄰苯二胺，置于含20 mL無(wú)水乙醇的錐形瓶中，攪拌后超聲15 min使其充分溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜后置于烘箱內(nèi)，180℃反應(yīng)10 h，待水熱反應(yīng)釜完全冷卻至室溫。隨后將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)濾后旋蒸除去乙醇溶劑，并重新分散在超純水中，超聲使其完全溶解，再用0.22μm濾膜過(guò)濾后得到黃褐色碳點(diǎn)溶液。將上述黃褐色碳點(diǎn)水溶液冷凍干燥48 h，即得到Fe-CDs固體狀粉末。