目的觀察氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態(tài)的影響，并探討其機(jī)制。方法選取美國癌癥研究所雄性小鼠56只，體質(zhì)量20～25 g，均為5周齡，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為四組：假手術(shù)組（A組）、假手術(shù)+氫氣組（B組）、膿毒癥組（C組）和膿毒癥+氫氣組（D組），每組14只。采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備小鼠膿毒癥模型。B組和D組于CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。CLP后24 h進(jìn)行行為學(xué)評分；采集靜脈血檢測血中生化指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）]；隨后處死小鼠取中段空腸，對腸道組織進(jìn)行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）染色，觀察腸道組織細(xì)胞凋亡情況并評分；檢測血液及腸道組織勻漿中丙二醛（MDA）水平及過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力。結(jié)果與A組比較，C組和D組行為學(xué)評分、腸道組織凋亡指數(shù)、血生化指標(biāo)（ALT、AST、BUN、Cr）水平及血清和腸道組織MDA水平升高，SOD和CAT活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B組上述指標(biāo)與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，D組行為學(xué)評分、腸道組織凋亡指數(shù)、血生化指標(biāo)水平及血清和腸道組織MDA水平降低，SOD和CAT活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸損傷和腸黏膜屏障功能破壞有明顯保護(hù)作用，可能與其抗凋亡作用及對內(nèi)源性氧化還原平衡狀態(tài)的維持有關(guān)。

膿毒癥是臨床上常見的一種復(fù)雜的綜合征，病理生理特征為炎癥系統(tǒng)過度激活所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、氧化應(yīng)激損傷、高凝狀態(tài)、組織低灌注導(dǎo)致的全身組織缺氧、代償性抗炎反應(yīng)綜合征及最終階段的多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction，MODS）。越來越多的研究表明，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生及抗氧化防御系統(tǒng)功能的降低在膿毒癥的發(fā)病過程中起著重要作用。因此，近來研究者們將膿毒癥治療的重點(diǎn)從控制失控的炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)移到對ROS的清除和機(jī)體氧化還原平衡的維持方面。

腸道組織在腸腔內(nèi)容物與機(jī)體之間形成2層屏障：物理/解剖屏障和免疫屏障。物理屏障是由一層互相聯(lián)結(jié)在一起的上皮細(xì)胞構(gòu)成，上皮細(xì)胞與固有層共同構(gòu)成腸道黏膜層。腸道黏膜一方面負(fù)責(zé)腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時把腸腔內(nèi)多種有毒的物質(zhì)與身體隔離開。腸道組織內(nèi)這一微妙的平衡機(jī)制的破壞是多種疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。大量動物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，腸道屏障功能破壞能造成腸腔內(nèi)抗原、微生物和有害代謝產(chǎn)物向血循環(huán)中移位，在多種炎癥性疾病的發(fā)病過程中起到重要作用，如手術(shù)后或創(chuàng)傷后SIRS、膿毒癥和MODS。前期的研究已經(jīng)證實(shí)，膿毒癥中即使通過控制血流的方法改善組織氧合，腸道組織仍是極易受累的器官。

腸道功能的改變在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，受損的腸道組織通過促進(jìn)病原微生物的侵襲及細(xì)菌毒性代謝產(chǎn)物的移位，在SIRS的發(fā)生中起著重要的推動作用，從而產(chǎn)生了一種新的理論——腸道是膿毒癥發(fā)病的動力器官。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到特別重視，而腸黏膜屏障功能失調(diào)是膿毒癥患者最常見的腸道并發(fā)癥。腸黏膜屏障功能失調(diào)可以促進(jìn)腸道菌群的異常增殖和細(xì)菌異位，導(dǎo)致二重感染和MODS的發(fā)生。腸黏膜屏障功能失調(diào)的機(jī)制可能包括膿毒癥全身炎癥細(xì)胞的異常激活與促炎性細(xì)胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產(chǎn)生造成氧化應(yīng)激狀態(tài)，這也是造成膿毒癥患者M(jìn)ODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。因此，針對腸黏膜屏障功能失調(diào)的有效治療措施有可能為臨床膿毒癥患者的治療帶來新的希望。

本研究擬利用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法誘導(dǎo)的小鼠重度膿毒癥模型，通過全身各主要臟器生化指標(biāo)[丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力]的測定證實(shí)膿毒癥全身損傷的存在，在此基礎(chǔ)上給予2%氫氣吸入治療，以明確氫氣的抗氧化特性及對機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能的影響在模型中發(fā)揮的治療作用。并重點(diǎn)觀察給予氫氣治療后重度膿毒癥小鼠模型中腸道組織的病理變化和細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。

Unisense氫氣電極的應(yīng)用

使用氫微電極（Unisense）原位測量重度膿毒癥小鼠腸道中的H2濃度來確定體內(nèi)氫捕獲情況。重度膿毒癥小鼠靜脈注射10 mg/kg Pd顆粒，12 h后，吸入4%氫氣3 h。吸入氫氣后，通過腹膜內(nèi)注射7 mL/kg 20%氨基甲酸乙酯立即麻醉小鼠。腹部正中切口暴露腸道，Clark型氫氣微電極插入腸道1mm，檢測局部H2。實(shí)時集中麻醉和微電極穩(wěn)定的整個過程僅用了3分鐘，并且在個體之間是一致的。僅使用不注入Pd的氫氣吸入作為對照，以區(qū)分腸道中Pd納米粒子的局部氫捕獲能力。

討論

本研究通過CLP法制備小鼠膿毒癥模型觀察氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，CLP后小鼠行為學(xué)評分降低，生化指標(biāo)出現(xiàn)異常，表明膿毒癥模型制備成功；CLP后腸道組織凋亡指數(shù)升高，提示膿毒癥誘發(fā)腸道損傷模型制備成功。

本課題組前期研究表明，CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h可提高膿毒癥小鼠生存率，故本研究選擇CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。結(jié)果表明，吸入氫氣后，膿毒癥小鼠行為學(xué)評分和相關(guān)血生化指標(biāo)降低，腸道凋亡指數(shù)降低，表明氫氣減輕了小鼠膿毒癥誘發(fā)的腸黏膜損傷。

有研究已經(jīng)證明，在膿毒癥的發(fā)展過程中，腸道是極易受累的器官。受損的腸道組織通過促進(jìn)腸腔內(nèi)抗原、微生物和有害代謝產(chǎn)物向血循環(huán)中移位，在SIRS的發(fā)生中起著重要的推動作用進(jìn)而產(chǎn)生了一種新的觀點(diǎn)——腸道是膿毒癥病程進(jìn)展的動力器官。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到越來越多的重視，而腸黏膜屏障功能受損是膿毒癥患者最常見的腸道并發(fā)癥。腸黏膜屏障功能失調(diào)可以促進(jìn)腸道菌群的異常增殖和細(xì)菌異位，導(dǎo)致二重感染和MODS的發(fā)生。Doig等在危重癥患者中開展的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)，腸黏膜屏障功能缺陷與重癥患者M(jìn)ODS的發(fā)生及預(yù)后存在顯著相關(guān)性。腸黏膜屏障功能損傷的機(jī)制可能包括膿毒癥患者全身炎癥細(xì)胞的異常激活與促炎性細(xì)胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產(chǎn)生可造成氧化應(yīng)激狀態(tài)，這也是造成膿毒癥患者M(jìn)ODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。

生理情況下，由于線粒體電子逸出或還原型輔酶Ⅱ、黃嘌呤氧化酶等氧化酶的作用，機(jī)體內(nèi)不斷產(chǎn)生具有生理活性的ROS，如超氧離子、過氧化氫等，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能；并且能夠被SOD、CAT、谷胱甘肽等抗氧化酶類及時清除。在膿毒癥的眾多發(fā)病機(jī)制中，氧自由基損傷扮演著重要角色。膿毒癥時可激活中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量的ROS。有害的ROS大量堆積，通過多種途徑對機(jī)體造成損傷，直接導(dǎo)致生物膜損傷和各種功能障礙，破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而加劇細(xì)胞凋亡活動，導(dǎo)致DNA嚴(yán)重?fù)p傷，使DNA鏈發(fā)生難以修復(fù)的斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)通過測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平來反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)果在膿毒癥模型組腸組織中發(fā)現(xiàn)MDA水平明顯增高，氫氣吸入后這種增高趨勢被抑制，說明腸道組織氧化損傷的存在，以及氫氣對有害自由基的選擇性清除作用。而抗氧化酶（CAT、SOD等）可以減輕氧化應(yīng)激對組織、細(xì)胞及微結(jié)構(gòu)造成的損傷。從本實(shí)驗(yàn)不難看出，與假手術(shù)組相比，重度膿毒癥小鼠血清及腸組織中SOD和CAT活力顯著降低。

綜上所述，氫氣通過對ROS的選擇性清除、對細(xì)胞凋亡的抑制，以及對機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的激活，在膿毒癥腸道損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。