采用高分辨率光纖氧微電極測定了富營養(yǎng)化水體中沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)莖葉微界面(0—2.0mm)氧(O2)。菹草葉微界面O2濃度梯度具明顯的時(shí)空變化。時(shí)間上，菹草葉微界面O2濃度具有明顯的生長階段變化和晝夜變化。幼苗期和快速生長期微界面O2濃度增加幅度較小，穩(wěn)定期葉表O2濃度梯度增加幅度最大，衰亡期葉微界面O2濃度受附著物影響具明顯的空間梯度。菹草葉微界面O2表現(xiàn)為晝高夜低的單峰變化模式，主要受光照和溫度的影響?？臻g上，越接近莖葉表面，O2濃度越高。頂部幼葉微界面O2濃度梯度增加較平緩，中部成熟葉微界面O2濃度梯度變化最陡，波動(dòng)幅度最大，中部莖和基部衰老葉微界面O2濃度梯度由于受密集附著物的影響，在附著物表面達(dá)到最大值，進(jìn)入附著層后略有下降。結(jié)果表明，菹草莖葉微界面O2時(shí)空變化主要受附著物和植物光合放氧能力的影響。光纖微電極是一種分析植物葉微界面氧時(shí)空分布的理想工具，對深入研究植物微界面在富營養(yǎng)化水體中養(yǎng)分的遷移轉(zhuǎn)化具有重要意義，可為水生植物生理生態(tài)研究提供有力工具。

Reddy發(fā)現(xiàn)濕地植物根系附近存在富氧-厭氧微環(huán)境，提出并用同位素技術(shù)證實(shí)了根-沉積物界面的硝化-反硝化理論，并結(jié)合微電極取得一系列重要的成果。理論上，沉水植物的莖葉與水之間亦存在類似于根-土壤/沉積物的微環(huán)境(界面)。位于水面以下的沉水植物莖葉表面常有各種藻類、微生物、菌膠團(tuán)、泥沙和碎屑等物質(zhì)附著，形成了特殊的生物-水微界面。

沉水植物光合作用產(chǎn)生的氧氣通過莖葉表面散逸到水中，在莖葉表面形成富氧區(qū)，而附著層內(nèi)富集的有機(jī)質(zhì)分解耗氧容易導(dǎo)致莖葉表面成為缺氧微區(qū)，這可能將對微界面內(nèi)物質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化有重要影響。研究表明淡水沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)和海洋植物褐藻(Fucusvesiculosus)葉微界面(0—2.0mm)內(nèi)O2濃度空間分布差異比較明顯，但僅有的上述研究均集中在光對特定生長階段水生植物葉微界面O2分布的影響上。不同生長階段、不同部位沉水植物微界面O2分布有何差異？附著物對沉水植物微界面O2分布有何影響？對此人們還了解甚少。

鑒此，本研究利用光纖氧微電極技術(shù)，分別從時(shí)間(晝夜、季節(jié))和空間(不同部位)尺度上研究了菹草莖葉微界面O2的分布，揭示了造成其時(shí)空差異的可能機(jī)理，對深入研究富營養(yǎng)化水體中植物衰退機(jī)制和養(yǎng)分循環(huán)具有重要意義。

1、材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菹草采自南京市富營養(yǎng)化水體(總氮TN) = (1.05±0.07) mg/L,總磷(TP) = (0.11±0.02) mg/L,NH+4-N = (0.12±0.03) mg/L,葉綠素a = (18.15±3.41) mg/L,透明度= (0.40±0.08) m,化學(xué)需氧量(CODMn) = (7.95±0.27) mg/L) 三用河(32°06’N,118°55’E)，自2013年3月上旬至6月上旬，分別在菹草幼苗期、快速生長期、穩(wěn)定期和衰亡期采集整株植物5—7 株，置于裝有冰袋的保溫箱中，同時(shí)采集原位水5000 mL，為避免菹草附著物在運(yùn)輸過程中脫落，植物和水分別裝在不同的容器中。2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，植物莖葉微界面O2 置于原位水中穩(wěn)定3 d后測定，水質(zhì)指標(biāo)12 h內(nèi)測定。同時(shí)利用水下調(diào)制熒光儀DIVING-PAM (Walz GmbH,Effeltrich,德國)現(xiàn)場原位無損傷測定菹草的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。在菹草穩(wěn)定期，另采集整株成熟菹草3—5株(株高(120.0±5.1) cm，葉片數(shù)52±5)用于測定不同部位(圖 1a)微界面O2，幼葉(位于頂端附近且完全展開的葉)、成熟葉(莖中部(葉長(5.0±0.3) cm，葉寬(0.5±0.02) cm)，葉面積達(dá)到最大但無衰老跡象)、衰老葉(莖基部附近，明顯發(fā)黃)、莖(中部，成熟葉著生附近)。

1.2菹草莖葉微界面O2的測定

將整株菹草置于裝有原位水的方形玻璃缸中，使整株植物懸浮在水中，莖和葉片用訂書針固定在瓊脂板上(4%)(圖1b)。通過控溫臺(tái)使水溫保持在(20±0.5)℃。在鹵素光纖燈(150W)控制光密度100μmol photons/m2s下進(jìn)行測定。采用針式光纖氧微電極(丹麥Unisense)進(jìn)行測定。電極尖端直徑<50μm，快速響應(yīng)時(shí)間小于3s，在線溫度補(bǔ)償，檢測范圍為0—250%飽和空氣(0—22.6mg/L)，檢測下限為0.2%飽和空氣。使用前用飽和濕空氣(100%O2)和飽和Na2SO3溶液(0%O2)進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)。將電極固定在三維自動(dòng)操縱器上，控制電極以設(shè)定的步進(jìn)接近莖葉表面。借助解剖顯微鏡跟蹤電極的移動(dòng)，用來確定菹草附著物的表面，可結(jié)合顯微鏡與電極信號(hào)變化來判斷葉表面。數(shù)據(jù)通過軟件Microx TX3獲取。每個(gè)莖葉測定3個(gè)不同點(diǎn)，由于電極穩(wěn)定性較好，每個(gè)點(diǎn)測2個(gè)剖面，取3個(gè)點(diǎn)的平均值作圖。

圖1成熟菹草和測試圖

1.3菹草葉面O2晝夜變化的測定

在菹草穩(wěn)定期，采集完整成熟菹草3株，用原位水置于方形玻璃缸中在溫室內(nèi)馴化培養(yǎng)3d后測定(圖1b)。選擇晴朗天氣(2013年4月26日6:00—27日早6:00)江蘇省生態(tài)修復(fù)平臺(tái)玻璃溫室中進(jìn)行，借助顯微鏡和電極信號(hào)，找到葉片表面，10min自動(dòng)記錄一次數(shù)據(jù)，連續(xù)測定24h。測定O2和溫度的同時(shí)，采用ZDR—14型照度記錄儀同步記錄光強(qiáng)。2013年4月26日6:00—27日6:00，溫度最高30℃，最低13℃，據(jù)國家授時(shí)中心網(wǎng)站(http://time.kepu.net.cn/)查詢得監(jiān)測時(shí)段日出、日中、日落時(shí)刻。4月26日日出時(shí)刻為05:24，日中時(shí)刻為12:03，日落時(shí)刻為18:42，4月27日日出時(shí)刻為05:23，日中時(shí)刻為12:03，日落時(shí)刻為18:42。故將26日6:00—18:42及27日05:23—6:00作為白晝。

1.4附著生物的分離與測定

從不同菹草植株上采集典型莖葉10g左右裝入盛有200mL無菌水的聚乙烯瓶中，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，帶回實(shí)驗(yàn)室。用軟毛刷和無菌水輕輕刷洗植物表面，用顯微鏡觀察確保附著物完全刷下且莖葉表面未受損。刷洗液連同軟毛刷沖洗液一并收集，將收集的樣品定容500mL。將得到的附著物懸濁液分成四等份，兩份通過預(yù)燒和預(yù)稱重的Whatman GF/C濾膜(孔徑0.45μm)(用于干重分析)真空抽濾，另兩份通過醋酸纖維濾膜(孔徑0.45μm)(用于葉綠素a分析)真空抽濾。附著物干重(DW)通過真空抽濾后將帶有附著物的濾膜在105℃下烘24h測定。附著物灰分重(AW)通過抽濾物在馬弗爐中550℃燃燒4h測得。附著物的無灰干重(AFDW)通過燃燒損失的質(zhì)量干重與灰分重之差計(jì)算得到，也可表示附著有機(jī)物含量。附著物葉綠素a(Chl a)采用標(biāo)準(zhǔn)方法，用90%的丙酮提取，分光光度法測定。得到的結(jié)果通過植物單位干重計(jì)算。

1.5快速光響應(yīng)曲線的測定

菹草快速光響應(yīng)曲線(Rapid light curves，RLCs)采用水下熒光儀Diving-PAM和數(shù)據(jù)采集軟件Wincontrol(Walz GmbH，Effeltrich，德國)進(jìn)行原位測定，測定具體操作方法參照文獻(xiàn)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析前，對所有的數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性的假設(shè)檢驗(yàn)。用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)不同生長階段附著物干重、灰分重、無灰干重和葉綠素含量的差異，如果差異顯著，進(jìn)一步通過Tukey HSD用單因素方差分析檢驗(yàn)(P﹤0.01)。不同部位附著物干重、灰分重、無灰干重和葉綠素含量的差異亦采用上述方法。采用Origin Pro 8進(jìn)行繪圖。

光纖氧微電極揭示菹草葉微界面O2分布、濃度梯度的時(shí)空變化（一）

光纖氧微電極揭示菹草葉微界面O2分布、濃度梯度的時(shí)空變化（二）

光纖氧微電極揭示菹草葉微界面O2分布、濃度梯度的時(shí)空變化（三）