研究簡(jiǎn)介:研究了淹水稻田土壤中好氧-缺氧界面處甲烷氧化細(xì)菌（MOB）的分布和活性。甲烷是重要的溫室氣體，而MOB通過消耗甲烷減少其排放到大氣中。研究者利用微宇宙和冷凍切片技術(shù)，對(duì)土壤頂部3毫米進(jìn)行了100微米級(jí)別的采樣，并使用pmoA基因作為功能和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，通過t-RFLP、微陣列和克隆測(cè)序等方法分析了MOB群落結(jié)構(gòu)和活性。研究發(fā)現(xiàn)，在好氧-缺氧界面附近，甲烷氧化活性最高，89%的總呼吸作用被限制在一個(gè)0.67毫米厚的區(qū)域內(nèi)。與Methylobacter相關(guān)的OTU在這一區(qū)域非?；钴S，每個(gè)細(xì)胞中pmoA轉(zhuǎn)錄本高達(dá)18個(gè)，表明它適應(yīng)了微摩爾范圍內(nèi)的氧和甲烷濃度。此外，與Methylosarcina相關(guān)的OTU與表層區(qū)域相關(guān)聯(lián)，該區(qū)域高氧但甲烷濃度僅為納摩爾級(jí)，表明這個(gè)OTU適應(yīng)了貧營(yíng)養(yǎng)條件。研究結(jié)果表明，不同的MOB OTU可以共享相同的微環(huán)境，并利用不同的生態(tài)位，這對(duì)于理解和管理甲烷排放具有重要意義。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

unisense氧氣微電極（型號(hào)OX50）被用來確定微環(huán)境中垂直氧氣分布情況。通過使用氧氣微電極，研究者能夠在微宇宙中精確測(cè)量氧氣濃度的垂直梯度，從而確定好氧-缺氧界面的精確位置。通過測(cè)量氧氣濃度的垂直分布，計(jì)算出土壤中氧氣的消耗率，從而能夠理解甲烷氧化過程對(duì)總呼吸作用的貢獻(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

揭多樣的甲烷氧化菌群落中的有限子集是活躍的，而且大多數(shù)活動(dòng)被限制在0.67毫米厚的區(qū)域。然而，我們的實(shí)驗(yàn)顯示了單一群落中不同OTU如何共享相同的微環(huán)境，從而利用不同的生態(tài)位。我們假設(shè)活性在MOB根據(jù)底物可用性分隔的氧-厭氧界面處最高。這確實(shí)是事實(shí)，Methylobacter相關(guān)的OTU和總體甲烷氧化的主導(dǎo)位于氧-厭氧界面。這個(gè)OTU似乎很適應(yīng)于氧-厭氧界面，在那里氧氣和可能是甲烷的濃度都在微摩爾范圍內(nèi)。這個(gè)OTU在表層，其氧氣濃度高而甲烷濃度只有納摩爾范圍時(shí)是不活躍的。相反，Methylosarcina相關(guān)的OTU的轉(zhuǎn)錄本與表層層次相關(guān)，這表明其適應(yīng)寡營(yíng)養(yǎng)條件。

圖1、氧氣濃度和來源于pmoA基因及其轉(zhuǎn)錄本的垂直剖面。(a)用微電極測(cè)得的平均氧剖面。從圖中可以看出，氧濃度近似線性下降到深度約1.3毫米，然后在約1.8毫米深度之前，濃度呈明顯的彎曲達(dá)到零。(b)DNA和(c)RNA的pmoA tRF的相對(duì)豐度。tRF的系統(tǒng)發(fā)育從屬關(guān)系以及其大小用括號(hào)標(biāo)明。rRNA：來自非特異性逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增16S和23S rRNA序列的不同tRF的相對(duì)豐度的合并值；RPCs：稻田簇的相對(duì)豐度。

圖2、四個(gè)microcosms中基于DNA的群體結(jié)構(gòu)的垂直分化。II型和Ia型MOB的平均相對(duì)豐度。II型對(duì)應(yīng)于tRF 244；Ia型是所有其他片段的總和。與RT-PCR不同，DNA基礎(chǔ)的分析沒有遭受rRNA基因的非特異性擴(kuò)增。

圖3、Methylobacter相關(guān)片段（tRF 508）的競(jìng)爭(zhēng)性t-RFLP分析。顯示了pmoA基因拷貝數(shù)和pmoA RNA/DNA比率，帶有Sawitzky–Golay平滑器（n=5）。根據(jù)圖1a中顯示的微剖面使用Berg的程序PROFILE ver.1.0（Berg等人，1998年）計(jì)算了氧氣消耗速率，考慮了頂部2毫米。

圖4、轉(zhuǎn)錄模式的非度量多維標(biāo)度（NMDS；Bray-Curtis相異性；應(yīng)力?0.0689；R2=0.997；線性擬合，R2=0.989）通過pmoA微陣列雜交獲得的平均值；來自四個(gè)微環(huán)境。圖層顯示為黑色符號(hào)。綠色、紅色和藍(lán)色外殼分別顯示了三個(gè)不同的區(qū)域（表面，0–0.8 mm；缺氧-缺氧界面，0.8–2 mm和缺氧，2–3 mm）。區(qū)域之間的差異非常顯著（相似性分析，Bray-Curtis相異性，Po0.001）。紅色符號(hào)標(biāo)記不同的探針。探針O_Mmb562對(duì)甲基藻具有特異性，將表面區(qū)域與其他兩個(gè)區(qū)域分開的。

結(jié)論與展望

好氧甲烷氧化細(xì)菌（MOB）使用有限的底物范圍，然而在一個(gè)稻田土壤中發(fā)現(xiàn)了430個(gè)物種等效的操作分類單元（OTUs）。這些OTUs如何在物理上共享它們的微生境尚不清楚。研究人員高度解析了MOB及其活性的垂直分布。使用microcosms和冷凍切片，在近原位條件下，在水飽和土壤的頂部3毫米中以100微米的步長(zhǎng)進(jìn)行了子采樣。使用顆粒態(tài)甲烷單加氧酶基因pmoA作為功能和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，通過末端限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（t-RFLP），pmoA特異性的診斷微陣列以及克隆和測(cè)序來評(píng)估群落結(jié)構(gòu)和活性。通過競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合t-RFLP來定量pmoA基因和轉(zhuǎn)錄本。

只有甲烷氧化引起的可能令人滿意的總呼吸的89％限于氧-缺氧界面上方0.67毫米的厚度，這個(gè)界面可能由于甲烷氧化而引起。在這個(gè)區(qū)域，與甲烷濃度和氧氣濃度在微摩爾范圍內(nèi)相關(guān)的一個(gè)與甲烷桿菌相關(guān)的OTU表現(xiàn)出極高的活性，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)18個(gè)pmoA轉(zhuǎn)錄本，并且似乎適應(yīng)于氧氣和甲烷濃度。使用pmoA特異的微陣列分析轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)與表面區(qū)相關(guān)的一個(gè)與甲烷球菌相關(guān)的OTU。表面的高氧氣體但只有納摩爾的甲烷濃度表明該OTU適應(yīng)于寡營(yíng)養(yǎng)條件。沒有發(fā)現(xiàn)II型甲烷氧化細(xì)菌（Methylosinus，Methylocystis）的轉(zhuǎn)錄本，這表明該組僅由休眠階段代表。因此，在單一行業(yè)內(nèi)的不同OTUs共享相同的微環(huán)境并利用不同的生態(tài)位。Unisense的氧氣微電極技術(shù)為這項(xiàng)研究提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具，使得研究者能夠在微觀尺度上精確測(cè)量氧氣濃度，這對(duì)于揭示甲烷氧化細(xì)菌在淹水稻田土壤中的生態(tài)位分配和活性具有重要意義。